人RAD23同源物B(RAD23B) ELISA 試劑盒
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1. 預期用途
本試劑盒設計用于定量檢測血清、血漿、組織勻漿、細胞上清、細胞裂解物等樣本中的RAD23B濃度，僅供研究使用，不得用于醫學診斷。
2. 檢測原理
試劑盒采用雙抗體夾心法原理：將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及校準品中待測物，加入辣根過氧化物酶標記的酶標二抗，結合形成“抗體-抗原-抗體-HRP”免疫復合物，加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中待測物的濃度。
3. 包含的實驗材料實驗材料
名 稱 Label | 組成成分 Kit Components | 數量（48T） Quantity | 數量（96T） Quantity |
酶標板 | 預包被捕獲半抗原的酶標板 | 8×6條 | 8×12條 |
校準品（10×） | 待測靶抗原（100ng/mL） | 1支×100μL | 1支×200μL |
酶標抗體（100×） | HRP酶標記的檢測抗體 | 1支×50μL | 1支×100μL |
通用稀釋液 | 樣品/校準品/酶標抗體通用稀釋液 | 1支×15mL | 1支×25mL |
濃縮洗液（20×） | 20倍濃縮洗液 | 1支×15mL | 1支×25mL |
顯色劑 | TMB、過氧化氫 | 1支×6mL | 1支×10mL |
終止液 | 稀硫酸、抗沉淀劑 | 1支×3mL | 1支×6mL |
如需單獨采購通用型組分，請提供對應的組分名稱。
4. 需要但未包含的實驗材料
· 蒸餾水或去離子水，一次性離心管、一次性手套等耗材；
· 移液器、多通道移液器及配套槍頭；
· 燒杯、量筒、試劑瓶等容器具；
· 用于封貼微孔板的封板膜或其他替代材料；
· 微孔板振蕩器（如有需要）、離心機、旋渦振蕩器等輔助設備；
恒溫培養箱、恒溫水浴箱、酶標儀、洗板機。
5. 試劑的準備及儲存
· 試劑盒各組分應儲存于2~8℃保存；
· 使用前請確保試劑盒按規定的條件儲存，每次實驗僅準備所需實驗用量的試劑，試劑盒最多可以使用3次；
· 校準品開封前應離心30秒，確保所有校準品集中于底部；
· 1×洗液的配制：濃縮洗液（20×）如有晶體析出，需在37℃下加熱至晶體全部溶解后使用。用蒸餾水1:20稀釋，例如：10mL濃縮洗滌液加入190mL的蒸餾水，混合均勻。配制好的洗液可以在2~8℃保存1周；
· 校準品的配制：準備7個試管，先將10×校準品按需吸取一定量用“通用稀釋液”稀釋10倍配制成檢測線性范圍上限校準品S1。（例：50uL的校準品（10×）+450uL的“通用稀釋液”，制備得到500μL的S1濃度校準品）。隨后在6個離心管中分別加入250μL的“通用稀釋液”，在這6個試管中（S2~S7）將S1校準品依次倍比稀釋6個梯度至S7，共配制7個濃度的校準品，依次為：S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7，如下圖所示，“通用稀釋液”作為零濃度校準品S0。
1×酶標抗體工作液的配制：（100×）酶標抗體工作液用“通用稀釋液”按1:100倍稀釋，例如：10uL的（100×）酶標抗體加入990uL的“通用稀釋液”，混合均勻。配制好的1×酶標抗體工作液可以在2~8℃保存8h。
6. 樣品采集、預處理及儲存
下面列出的樣品收集和儲存條件旨在作為一般性指導，不同類型樣品的儲存、使用穩定性尚未完全評估。
· 血清：使用血清采集管采集全血，室溫靜置待血細胞凝集后取的血清，或直接在1000×g下離心15分鐘取得血清。操作應柔和，避免溶血發生。獲取的血清應及時進行檢測，如不能及時進行檢測，應等分為多份，儲存在-20℃及以下溫度條件，儲存時間不超過6個月，冷凍儲存血清樣品凍融不超過2次。
· 血漿：使用EDTA或肝素采血管收集血漿。全血采集后以1000×g離心15分鐘取得血漿。操作應柔和，避免溶血發生。獲取的血漿應及時進行檢測，如不能及時進行檢測，應等分為多份，儲存在-20℃及以下溫度條件，儲存時間不超過6個月，冷凍儲存血漿樣品凍融不超過2次。
· 組織：用預冷的PBS（0.01M，pH=7.4）沖洗組織，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織加入裂解液，一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的裂解液，具體可根據實驗需要適當調整，裂解液應加入蛋白酶抑制劑，于冰上對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測。
· 細胞：取適量細胞，于冰上進行超聲破碎，5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測。
· 細胞上清：取細胞上清于5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測。
7. 實驗步驟
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右，也可置于37℃溫箱快速回溫至室溫。
注意：酶標板未恢復室溫前，請勿開封。
1 | 校準品孔每孔加入100μL校準品S0-S7 |
2 | 待測樣品孔每孔加入通用稀釋液50uL，再加入樣品50uL。（樣品稀釋2倍*） |
3 | 蓋上封板膜，在37℃下孵育60分鐘。 |
4 | 洗板5次，最后一次洗板后棄去殘留洗液，倒扣酶標板，在干凈的吸水紙上拍干。 |
5 | 每孔加入100μL預先配制好的1×酶標抗體工作液。 |
6 | 蓋上封板膜，在37℃下孵育60分鐘。 |
7 | 洗板5次，最后一次洗板后棄去殘留洗液，倒扣酶標板，在干凈的吸水紙上拍干。 |
8 | 每孔加入100μL顯色液 |
9 | 37℃下避光孵育15分鐘。 |
10 | 每孔加入50μL終止液。 |
11 | 使用酶標儀在450nm檢測波長及620~690nm參比波長條件下測定吸光度值，如果沒有參比波長則僅選擇450nm波長進行檢測。如果最高濃度校準品OD值過高，應立即在405/630nm雙波長條件下檢測。 |
*如樣本珍貴量少，可適當加大稀釋倍數。
8. 結果計算
使用專業化軟件進行結果擬合和計算，如ELISACALC、SPSS、Graphpad Prism等。以濃度值為橫坐標，吸光度值為縱坐標，四參數邏輯（4-P）曲線擬合。
注意事項： 樣本濃度應當乘上稀釋倍數。
示例數據
以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗數據建立標準曲線。
9. 檢測的局限性
樣本濃度超出檢測范圍上限時，應當進行適當加大稀釋倍數后再次檢測，計算結果應當乘上稀釋倍數。樣本濃度低于LOQ定量限時，檢測結果無法進行準確定量。
10. 產品性能指標
以下結果基于校準品的濃度值實驗得出，未納入基質效應等其他因素的潛在影響。
靈敏度：0.054 ng/mL
線性范圍：0.16-10 ng/mL
精密度：板內精密度CV＜10%（N=20），板間精密度CV＜15%（N=20）。
特異性（Analytical specificity）：其他相關因子在稀釋緩沖液中制備為10μg/mL測定，沒有觀察到明顯的交叉反應。?
11. 注意事項
· 試劑盒內所有成分僅供研究使用！
· 終止液含稀硫酸，具有腐蝕性，應謹慎操作。
· 試劑盒成分含防腐劑、蛋白成分等，可能引起皮膚過敏反應，應佩帶口罩避免吸入薄霧。
· 顯色劑、濃縮洗液可能引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應佩帶口罩避免吸入薄霧。
· 佩戴防護手套、防護服、眼睛和面部防護用品，實驗操作后徹底洗手。
12. 技術要點
· 不同批次的試劑盒不能混用，不建議將不同板上的微孔板條組裝在一塊板上檢測，盡管是同一批次試劑，也可能存在板與板之間的差異。
· 每次實驗時應當始終配制標準曲線平行檢測，不能將上一次的標準曲線用于下一次實驗結果的計算。
· 不要使用超過有效期的試劑盒進行檢測。
· 底物顯色劑應當為無色，如變藍表明已變質，不能應用于實驗。
· 使用適當的封板膜密封微孔板條，以便檢測結果更加可靠。
· 操作時盡量避免產生氣泡。不要將不同試劑瓶的瓶蓋交叉使用。
· 應當遵循說明書的操作進行實驗，不按照說明書的操作將導致實驗結果的變化，任何不遵循說明書的實驗操作應當事先詢問售后技術支持的建議。否則我們不保證實驗結果的可靠。
